一、基本原理

1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）用于IgG定量測定的文章，使得1966年開始用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測定方法。

這一方法的基本原理是：①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可極大地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。

二、方法類型和操作步驟

ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：

①固相的抗原或抗體；

②酶標(biāo)記的抗原或抗體；

③酶作用的底物；

根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀以及檢測的具備條件，可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。

（一）應(yīng)用親和素和生物素的ELISA

此方法是目前國內(nèi)主流ELISA試劑盒廠商最常用的方法，有廠商稱之為雙抗夾心法，但與真正的“雙抗夾心法”卻有著很大區(qū)別。

親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個分子由4個亞基組成，可以和4個生物素分子親密結(jié)合?，F(xiàn)在使用更多的是從鏈霉菌中提取的鏈霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又稱維生素H，分子量244.31，存在于蛋黃中。用化學(xué)方法制成的衍生物，生物素－羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與蛋白質(zhì)、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。親和素與生物素的結(jié)合，雖不屬免疫反應(yīng)，但特異性強，親和力大，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于1個親和素分子有4個生物素分子的結(jié)合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復(fù)合體。因此把親和素和生物素與ELISA偶聯(lián)起來，就能大幅提高ELISA的信號強度。

親和素－生物素系統(tǒng)在ELISA中的應(yīng)用有多種形式，可用于間接包被，亦可用于終反應(yīng)放大?？梢栽诠滔嗌舷阮A(yù)包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結(jié)合，通過親和素－生物素反應(yīng)而使生物素化的抗體或抗原固相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結(jié)合點充分暴露。另外，在常規(guī)ELISA中的酶標(biāo)抗體也可用生物素化的抗體替代，然后連接親和素-酶結(jié)合物，以放大反應(yīng)信號。橋聯(lián)法ABC-ELISA（avidin biotin complex-ELISA）夾心法測抗原的過程見圖1。

圖1、親和素-生物素系統(tǒng)ELISA

（二）競爭法

競爭法（圖2-1）可用于測定抗原，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：

（1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。

（2）待測管中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應(yīng)。如受檢標(biāo)本中無抗原，則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。如受檢標(biāo)本中含有抗原，則與酶標(biāo)抗原以同樣的機會與固相抗體結(jié)合，競爭性地占去了酶標(biāo)抗原與固相載體結(jié)合的機會，使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少。參考管中只加酶標(biāo)抗原，保溫后，酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)合可達最充分的量。洗滌。

（3）加底物顯色：參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標(biāo)本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標(biāo)本中抗原含量越多。

圖2-1、競爭法測抗原示意圖

（三）雙抗體夾心法

部分廠家習(xí)慣性把雙抗夾心法做出來的產(chǎn)品稱之為“一步法” “減步法” “one step” “quick” 等五花八門的名頭，但其真正操作步驟與雙位點一步法在操作上有很大區(qū)別。

雙抗體夾心法（圖3）是檢測抗原比較常用的方法，操作步驟如下：

圖3、雙抗體夾心法測抗原示意圖

（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。

（2）加受檢樣本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時間，讓樣本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。

（3）加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。

（4）加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進行該抗原的定性或定量。

根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物，即可用雙抗原夾心法測定標(biāo)本中的抗體。

（四）雙位點一步法

在雙抗體夾心法測定抗原時，如應(yīng)用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，則在測定時可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步（圖2）。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應(yīng)時間，如應(yīng)用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應(yīng)用使測定抗原的ELISA提高到新水平。

圖4、雙位點一步法示意圖

在一步法測定中，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)（hookeffect），類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本中待測抗原濃度相當(dāng)高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù)合物，所得結(jié)果將低于實際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

（五）間接法測抗體

間接法（圖5）是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：

（1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。

（2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過程中被洗去。

（3）加酶標(biāo)抗抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體，可用酶標(biāo)羊抗人IgG抗體。

（4）加底物顯色：顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量。

本法只要更換不同的固相抗原，可以用同一種酶標(biāo)抗體 檢測各種與抗原相應(yīng)的目標(biāo)待檢抗體。

圖5、間接法測抗體示意圖

（六）捕獲法測IgM抗體

捕獲包被法（亦稱反向間接法）ELISA，首要用于血清中某種抗體亞型成分（如 IgM）的測定。以目前常用的 IgM 測定為例，因血清中針對某種抗原的特異性 IgM 和 IgG 同時存在，而IgG可干擾 IgM 的測定。因此先將一切血清 IgM（包括異性 IgM 和非特異性 IgM）固定在固相上，在去除 IgG 后再測定特異性 IgM。IgM 抗體的檢測用于流行癥的前期確診中。先用抗人 IgM 抗體包被固相，以捕獲血清標(biāo)本中的 IgM（其間包括針對抗原的特異性 IgM 抗體和非特異性的 IgM）。然后加入抗原，此抗原僅與特異性 IgM 相結(jié)合。繼而加酶標(biāo)記針對抗原的特異性抗體。再與底物作用，呈色即與標(biāo)本中的 IgM 成正相關(guān)。此法常用于病毒性感染的前期確診。類風(fēng)濕因子（RF）相同能攪擾捕獲包被法測定 IgM 抗體，導(dǎo)致假陽性反響。因此中和 IgG 的間接法近來頗受喜愛，用這類試劑檢測抗 CMV IgGM 和抗弓形蟲 IgM 抗體已獲成功。操作步驟如下：

圖6、捕獲法測IgM抗體示意圖

（1）將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。

（2）加入稀釋的血清標(biāo)本：保溫反應(yīng)后血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。

（3）加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結(jié)合。洗滌。

（4）加入針對特異性的酶標(biāo)抗體：使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合。洗滌。

（5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標(biāo)本中的特異性IgM抗體存在，是為陽性反應(yīng)。

ELISA的技術(shù)要點

ELISA的技術(shù)要點包括三個方面：試劑的制備、反應(yīng)條件的選擇和操作的標(biāo)準(zhǔn)化。

一、試劑的制備

ELISA的主要試劑為固相的抗原或抗體、酶標(biāo)記的抗原或抗體和與標(biāo)記酶直接關(guān)聯(lián)的酶反應(yīng)底物。以下敘述這些試劑的原料和制備方法。

（一）固相載體

可作ELISA中載體的物質(zhì)很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后保留原來的免疫活性。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。在ELISA測定過程中，它作為載體和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)。加之它的價格低廉，所以被普遍采用。ELISA載體的形狀主要有三種：小試管、小珠和微量反應(yīng)板。小試管的特點是還能兼作反應(yīng)的容器，最后放入分光光度計中比色。小珠一般為直徑0.6cm的圓球，表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大增加。如用特殊的洗滌器，在洗滌過程中使圓珠滾動淋洗，效果更好。最常用的載體為微量反應(yīng)板，專用于ELISA測定的產(chǎn)品也稱為ELISA板，國際通用的標(biāo)準(zhǔn)板形是8×12的96孔式。為便于作少量標(biāo)本的檢測，有制成8聯(lián)或12聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標(biāo)準(zhǔn)ELISA板相同。ELISA板的特點是可以同時進行大量標(biāo)本的檢測，并可在特定的比色計上迅速讀出結(jié)果。現(xiàn)在已有多種自動化儀器用于微量反應(yīng)板型的ELISA檢測，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對操作的標(biāo)準(zhǔn)化極為有利。良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間和同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于配料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此每一批號的聚苯乙烯制品在使用前須檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被ELISA板各孔后，每孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)抗人IgG抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應(yīng)后分別測每孔溶液的吸光度?？刂品磻?yīng)條件，使各讀數(shù)在0.8左右。計算所有讀數(shù)的平均值。所有單個讀數(shù)與平均讀數(shù)之差應(yīng)小于10％。與聚苯乙烯類似的塑料為聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯板的特點為質(zhì)軟板薄，可切割，價廉、但光潔度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有時也略高。為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣，可用以下方法加以檢驗：用其它免疫學(xué)測定方法選出一個典型的陽性標(biāo)本和一個典型的陰性標(biāo)本。將它們分別進行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預(yù)定的ELISA操作步驟進行測定，然后比較測定結(jié)果。在哪一種載體上陽性結(jié)果與陰性結(jié)果判別最大，這種載體就是這一ELISA測定的最合適的固相載體。除塑料制品外，固相酶免疫測定的載體還有兩種材料：一是微孔濾膜，如硝酸纖維素膜、尼龍膜等，這類測定形式將在“膜載體的酶免疫測定”中介紹。另一種載體是以含鐵的磁性微粒制作的，反應(yīng)時固相微粒懸浮在溶液中，具有液相反應(yīng)的速率，反應(yīng)結(jié)束后用磁鐵吸引作為分離的手段，洗滌也十分方便，但需配備特殊的儀器。