內(nèi)參即是內(nèi)部參照（Internal control），是指在組織和細(xì)胞中表達(dá)相對穩(wěn)定的一類蛋白質(zhì)，通常由管家基因編碼。這些蛋白質(zhì)被用作檢測蛋白表達(dá)水平變化時的參照物，以確定實驗的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

在Western Blot實驗中，我們使用內(nèi)參其實就是使用與內(nèi)參對應(yīng)的抗體來檢測內(nèi)參的表達(dá)量。由于內(nèi)參在不同組織和細(xì)胞中的表達(dá)量相對穩(wěn)定，通過檢測每個樣品內(nèi)參的表達(dá)量，我們可以校正上樣誤差，從而獲得更可靠的半定量結(jié)果。使用內(nèi)參還可以作為空白對照，檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否完全，并檢查該實驗中的顯色或發(fā)光體系是否正常。通過選擇合適的內(nèi)參，可以將這些樣本之間的差異消除或最小化，減少實驗誤差，提高結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性。因此，選擇合適的內(nèi)參是Western Blot實驗的關(guān)鍵步驟之一。

根據(jù)所做的蛋白樣本的種屬確定，哺乳動物一般β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Na+/K+-ATPase等；植物樣本一般選擇Plant actin、Rubisco等；其他來源樣本應(yīng)參考文獻(xiàn)報道選合適蛋白作為內(nèi)參。

根據(jù)研究對象的不同，選擇不同的內(nèi)參對于檢測細(xì)胞中不同位置的蛋白非常重要。一般情況下，選擇β-actin和GAPDH作為總蛋白的內(nèi)參就可以滿足要求。然而，對于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞膜等不同位置的蛋白檢測，我們需要選擇相應(yīng)的內(nèi)參，以確保實驗結(jié)果具有科學(xué)性和可靠性。常用內(nèi)參抗體分子量及其定位情況如下：

在選擇內(nèi)參抗體時應(yīng)考慮目的蛋白分子量大小，通常要求目的蛋白與內(nèi)參蛋白分子量相差5kDa以上。例如，若檢測的目的蛋白分子量為45kDa，則不宜選擇分子量為42kDa的β-actin作為內(nèi)參，應(yīng)考慮選擇分子量為36kDa的GAPDH作為內(nèi)參。

在實際的實驗環(huán)境中，處理條件可能會影響一些內(nèi)參的表達(dá)，因此需要考慮研究的信號通路是否會對內(nèi)參的表達(dá)產(chǎn)生影響。例如，在糖代謝的研究中，不能使用GAPDH作為內(nèi)參，因為GAPDH是參與糖酵解過程中的酶，在某些細(xì)胞中，缺氧等條件會改變GAPDH的表達(dá)；在凋亡實驗時，Lamin等也不適合作為內(nèi)參；在加入抗有絲分裂和抗真菌藥物時，Tubulin的表達(dá)易受影響，不適合作為內(nèi)參等。因此，在設(shè)計實驗方案的時候應(yīng)考慮這些因素并參考相關(guān)文獻(xiàn)，在實驗過程中，還需要留意內(nèi)參表達(dá)是否出現(xiàn)異常等因素的考慮。