技術(shù)專欄

            ELK Biotechnology總結(jié)實驗大鼠、小鼠常用的采血方法
            供稿:技術(shù)部發(fā)布時間:2022-09-20瀏覽量:6131次

            常見小鼠采血方法

            小鼠是科研實驗中常用的實驗動物,但由于其體積小,血管細,采血難度大,進而影響采血的質(zhì)量。

            ELK簡要總結(jié)了常見的小鼠采血方法,僅供參考:

            一只成年小鼠的循環(huán)血量大約是1.5~2.5ml,大約體重的 6~8%。在對營養(yǎng)狀況良好的小鼠進行采血時,單次采血量最多可以到達循環(huán)血量的10%,(例:若20克小鼠,它的總血量約占1.2-1.4毫升,即每次取120ul-140ul血液不會對小鼠有太大的影響)。采血之后應(yīng)該給予溫熱的等滲溶液補充,可以在2~3個星期內(nèi)恢復原有的水平。兩周采血量小于血液循環(huán)的10%,單周小于7.5%,小鼠血液循環(huán)72ml/kg

            實驗室常用抗凝劑:乙二胺四乙酸(EDTA)鹽、枸櫞酸鹽、草酸鹽、肝素

            實驗室常用采血管:(采血后立即顛倒混勻8次)

            1.黑色:枸櫞酸鈉;血沉

             

            2.淺藍色:枸櫞酸鈉;血凝試驗(如PT、APTT)

            3.深藍色:肝素鈉或EDTA-Na2;血液微量元素

            4.紫色:EDTA-K2;血常規(guī)(血液細胞分析)

            5.綠色:肝素鋰;大部分生化、血氨

            6.灰色:血糖降解抑制劑和EDTA-Na2;血糖

            7.棕色:肝素鈉或EDTA-K2;血鉛

             

            8.淺黃色ACD管:葡萄糖、抗凝劑;血庫試驗

            9.淺黃色SPS管:SPS液、氯化鈉溶液;血液培養(yǎng)、微生物培養(yǎng)

            尾尖采血

             

            麻醉小鼠后,用溫水(但水溫不要過高)擦拭尾巴,引起輕微的血管擴張。

            用無菌手術(shù)刀、刀片或鋒利的剪刀,快速截斷小鼠尾尖0.5-1cm。如果需要多次采血,之后每次僅需截除2-3mm。

            可以從尾部向尾尖方向按摩,以增加血流(但是,這會降低血樣的質(zhì)量,增加溶血的風險)。也可以用毛細采血管收集血液,或直接滴入收集管中。采血結(jié)束后,按壓傷口或使用止血劑(如硝酸銀,6%液體火棉膠)來止血。每次采血量大約可達0.1ml。

             

            眼眶靜脈叢采血

             

            優(yōu)點:眼眶后靜脈叢采血法方法簡單,便于掌握。血流較快,采血量多,能在較短時間內(nèi)采約0.5mL血。傷口較小,愈合較快。成功率高,死亡率低。

            缺點:不能避免組織液的混入,對于血樣要求較高的研究應(yīng)謹慎使用。

            小鼠經(jīng)氣體麻醉后,左手拇指及食指壓迫小鼠的頸部兩側(cè),阻礙靜脈回流,使眼球充分外突,提示眼眶后靜脈叢充血。也可以將小鼠放置在側(cè)臥位,拇指與食指分別置于小鼠頭頂和下頜,將皮膚向后及向下拉。抓握時要避免對氣管施壓,否則可能會影響小鼠呼吸。

            將毛細采血管(建議采用0.5*100mm規(guī)格的毛細管,在使用前折成小段,每段大約3-4cm)置于內(nèi)側(cè)眼角處,并且以與鼻翼平面成30-45度沿內(nèi)眥插入內(nèi)眼角,滑入眼球后方,輕輕向眼底方向刺入。

            當感到有阻力時即輕輕旋轉(zhuǎn)采血管的同時施加壓力以切開靜脈叢,血液將通過毛細作用流入采血管。不能刺地過深,一般2-3mm即可。

            采血結(jié)束后,立即松開手指對小鼠的壓迫,使眼球復位,同時將采血器拔出??捎酶擅耷驂鹤⊙劭簦_保止血。一般眼眶靜脈叢采血量可以達到0.2-0.3ml。

             

             

            頜下靜脈采血

             

            綁定小鼠,可將小鼠側(cè)臥,使小鼠頭部盡量固定。在小鼠嘴角沿線與外眼角線橡膠處找到頜下靜脈的大致位置,會發(fā)現(xiàn)一個無毛的小點,有點像酒窩,基本位于嘴角遠端稍低于下巴線。

            針保持垂直于皮膚表面,刺入皮膚。深度不超過針頭的斜面(約3mm)。拔出針頭后,血液就會流出。為方便采血,可使小鼠頭部低于心臟高度。采血結(jié)束后,按壓以止血。一般采血量為0.2-0.5ml。

             

            隱靜脈采血(總量5%)

             

            將小鼠置于固定管或架中,但保持后腿可自由活動,剃除跗部的毛。為使膝蓋與踝關(guān)節(jié)之間的隱靜脈更加明顯,可以在后腿膝蓋以上使用止血帶。在近尾側(cè)的皮膚表面可以找到隱靜脈。

            針垂直于皮膚表面扎破血管。不要進針過深,以免刺穿肌肉或碰到骨頭。血液會從入針處慢慢流出,用毛細采血管收集,并松開止血帶。采血結(jié)束后,按壓傷口或使用止血劑(如硝酸銀)以止血,并將小鼠放回籠內(nèi)。

             

             

            舌下靜脈采血

             

            將小鼠麻醉后仰臥于實驗臺面上并固定。用眼科彎鑷將小鼠舌頭拉出,可明顯看到小鼠舌下靜脈。

            持采血針與舌面呈10°夾角插入舌下靜脈,見有回血緩慢抽取,直至采到所需血量。

             

            頸靜脈采血

             

            該方法采血量( 0.2 ml至近全血量) 及采血次數(shù)( 1~8次/d) 可隨分析目的而變動,適用于人手少、動物數(shù)量多、實驗時間緊以及藥代動力學等需連續(xù)少量取血的研究中。但要求技術(shù)熟練, 方能得心應(yīng)手。在一定時間內(nèi), 如果采血量和采血次數(shù)增加, 會使動物引起一定的應(yīng)激性反應(yīng)或采血部位的傷害。

            將動物胸前區(qū)采血部位皮膚消毒, 于胸前正中線約第四肋骨水平先用注射器針頭沿水平方向刺入皮膚。

            再向頸靜脈所在位置沿皮下進針, 針頭到達頸靜脈所在位置時, 輕引注射器內(nèi)筒使之呈負壓, 再使注射器與胸部表面成30°~ 40°角向頸靜脈刺入, 此時注射器應(yīng)與頸靜脈走行方向相一致。

            在刺入過程中, 速度要緩慢, 刺入的深度約5 mm, 在試探性緩慢刺入或拔出時, 如有血液自動流入注射器內(nèi)筒, 說明針尖已在頸靜脈內(nèi), 此時固定好動物, 勿使注射器針頭移動。

            也可將采血針抵在動物胸骨上以便于操作, 小心抽引注射器內(nèi)筒, 待血液足夠時, 拔出采血針, 用干棉球按壓止血。

             

            尾靜脈采血

             

            一個人可以用微型手電筒或LED小夜燈等緊貼尾靜脈,在燈光的照射下,尾靜脈會被很清晰的顯示,提高成功率。

            固定器(自行設(shè)計)小鼠,將尾巴拉直,用酒精棉球擦拭尾巴或者用熱水或者熱毛巾焐熱尾巴(熱水浸泡鼠尾), 使尾部靜脈擴張。

            用左邊手的食指,中指,無名指及大拇指將小鼠尾巴固定。

            握住1ml 注射器(選用29G的針頭為宜)前面0.1ml處,右手小指搭在拽著鼠尾的左手拇指處斜15°角緩慢進針(鼠尾遠端約1/3的位置)。適當增加內(nèi)壓看有無回血,若有回血則緩慢抽取所需血量,棉簽按壓止血。

             

             

            頜下靜脈采血

             

            將小鼠麻醉后,平躺放置在實驗臺面上,中指、食指固定小鼠尾部。

            用刀片輕劃小鼠尾側(cè)靜脈或尾正中動脈。待血液流出后,用移液槍吸取血液。取血完畢后,棉簽按壓止血。

             

             

            腹主動脈采血

             

            優(yōu)點:采血法取血量大、不易溶血,血液質(zhì)量較好,適用于多項目檢測,且不損傷器官,有利于病理組織學檢查。

            缺點:操作比較復雜,應(yīng)注意掌握適當?shù)穆樽砩疃?,防止心跳驟停,同時防止大鼠躁動。本方法造成的出血速度快,易造成出血性的心臟停跳,故要防止采血過程中出血。且本方法采血過程中如多次采血不宜拔出針頭。

            將大鼠腹腔注射麻醉劑后,直到身體全身變軟,把大鼠仰臥固定在手術(shù)臺上,背部可以放置—粗試管以充分暴露腹主動脈。

            常規(guī)消毒后用手術(shù)剪刀沿腹正中線剪開腹腔,用小鑷子輕輕扒開血管周圍脂肪,再用棉球把覆蓋在血管的多余脂肪擦干凈,直到清晰看清血管為止(用棉球可以盡量減少小血管破裂出血,影響接下來進針時的視線)。

            找腹主動脈(粉)在脊柱上面,腹腔靜脈血管(比腹主動脈粗,黑)旁,找到后,術(shù)者先固定血管,盡可避免血管移位,左手拇指和食指固定住血管兩旁的脂肪及其它臟器,無名指按住血管進針點的上端,降低血壓,可以避免血液濺出。

            右手持穿刺針,針尖斜面朝下,入針角度約(小于)30度左右,朝向心端方向刺入,深度以5m左右為宜,進針后可以用止血夾夾住針頭,可以避免麻醉不夠掙扎導致血管被針頭戳破。

            取完血后,用棉球輕壓針眼處,快速拔出針頭,可以反復采集多管的血樣進行不同項目的測試(一般體重200~300g大鼠可采血液8~10mL)。

             

            心臟采血(非必需勿用)

             

            優(yōu)點:取血快,血液不易凝集,心區(qū)面積大,進針準確性較高,可一針見血,且采血量能滿足大量試驗需要。

            缺點:采血成功率較小,死亡率高,心臟損傷較大,難以迅速愈合,不利于短期連續(xù)采血,亦無法確定是靜脈血還是動脈血。

            一般有3種心臟采血的姿勢:1、托起小鼠軀干使身體垂直與地面。身體直立以防止心臟的偏轉(zhuǎn)或胸部的扭曲。使用1毫升注射器和22g針頭。將針頭從胸部中央向下5mm處插入,深度5-10mm,將注射器與胸部保持25-30度;2、使小鼠仰臥固定,剪去胸前區(qū)被毛,皮膚消毒后,用左手食指在左側(cè)第3~4肋間觸摸到心搏處,右手持帶有4~5號針頭的注射器,選擇心搏最強處穿刺;3、使小鼠側(cè)臥,垂直于胸壁插入針頭。

            如果血液沒有立刻進入注射器,可以輕輕抽空針管,產(chǎn)生一個真空區(qū)。

            當注射器中出現(xiàn)血液時,將針管保持靜止并輕輕地抽拉活塞芯桿,以獲得更多的血液。一般可以采到0.8-1.0ml血液。

             

            摘除眼球采血

            用左手拇指、食指和中指抓取小鼠的頸部頭皮,小指和無名指固定尾巴,輕壓需要摘取的眼部皮膚,使眼球充血突出。

            用眼科剪剪去小鼠的胡須,防止血從胡須處順流而下引起溶血。

            用眼科彎鑷夾取眼球并快速摘取,并使血液從眼眶內(nèi)流入0.5mlEP管中。待小鼠取血完畢后,斷頸處死。

             

             

            斷頭采血

            用左手拇指和食指以背部較緊的捏住小鼠頸部皮膚,并作小鼠頭部朝下的姿勢。

            右手用剪刀猛剪鼠頸,約1/2-4/5的頸部剪斷,讓血滴入容器中。

             

             

            全血、血漿、血清的區(qū)別

            全血包括血細胞和血漿的所有成分。采集全血時,收集管中必須含有抗凝劑。常用的抗凝劑有:肝素、檸檬酸鈉和乙二胺乙酸酸 (EDTA)。根據(jù)不同研究需要進行選擇。

            血漿是全血經(jīng)抗凝處理后,通過離心沉淀,獲得的不含細胞成分的液體。含有纖維蛋白原、凝血因子等。

            血清是全血未經(jīng)過抗凝處理,血凝塊聚縮釋出的液體。其中沒有纖維蛋白原和凝血因子。

            分離血漿和血清的一般方法是:2200-2500rpm 離心至少15分鐘。

            正常的血清或者血漿樣本為黃色清液,而若為偏紅,即為有紅細胞破裂而產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。避免溶血應(yīng)注意以下的事項:

            1.采血時要避免小鼠毛發(fā)、油脂沾染血液導致溶血,所用的容器、注射器必須清潔干燥,不能有水或者有機溶劑。

            2.抽血時速度不要太快,速度太快會有氣泡產(chǎn)生。如果使用止血帶時,止血帶不要扎的太久。

            3. 抽出的血放入試管時,要先拔掉針頭再放血,同時速度不要太快。

            4. 收集分離血清的全血時應(yīng)盡量使血液直接進入小管底部,避免管壁或管蓋上的血液在離心過程中導致溶血

             

            樣本出現(xiàn)溶血還可以用ELISA方法檢測嗎?

            血樣采集操作失誤、強力震蕩和多次凍融都有可能引起溶血發(fā)生。

            在ELISA檢測中,若樣本溶血輕微(淺紅色),仍可做ELISA檢測,建議適當增加洗板次數(shù),減少背景過高影響;若溶血嚴重(深紅色),建議重新取樣。

            樣本溶血可能會引起ELISA檢測OD值升高、結(jié)果假陽性。

            原因可能是樣本中游離的血紅蛋白非特異性吸附在酶標板上,血紅蛋白中的亞鐵血紅素具有類似過氧化物酶的活性,其作用類似于辣根過氧化物酶,進而催化底物的反應(yīng)以增加樣品的OD值并引起假陽性。

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