01 uniprot

一般采用0.05mol/LTris-HCl,pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS),客戶(hù)可根據(jù)樣本及測(cè)定指標(biāo)的情況自行設(shè)定濃度,目的是保持樣本的等滲環(huán)境。

1、細(xì)胞沉淀的收集：

手工勻漿，超聲破碎,裂解液裂解,反復(fù)凍融。

①手工勻漿：在細(xì)胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根據(jù)所測(cè)指標(biāo)的不同而有所改變，一般加入0.5ml，細(xì)胞密度不小于一百萬(wàn)個(gè)/ml），混勻，將細(xì)胞懸浮于PBS中，用移液器將細(xì)胞懸浮液移至玻璃勻漿管中（2ml玻璃勻漿管），將玻璃勻漿管置于冰水混合物中，手動(dòng)勻漿3分鐘，然后取破碎好的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行測(cè)定。

②超聲破碎:

在細(xì)胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根據(jù)所測(cè)指標(biāo)的不同而有所改變，一般加入0.5ml，細(xì)胞密度不小于一百萬(wàn)個(gè)/ml），混勻，將細(xì)胞懸浮于PBS中，在冰水浴條件下進(jìn)行如下操作:

a、用超聲粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，可用Soniprep150型超聲波發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒使細(xì)胞破碎，也可用國(guó)產(chǎn)超聲波發(fā)生儀，用400安培，5秒/次，間隙10秒反復(fù)3～5次。

b、用超聲細(xì)胞破碎儀，300W功率，每次超聲3～5秒，間隔30秒，重復(fù)4～5次。

③裂解液裂解

常用裂解液有SDS、NP-40、TritonX-100,這三種去垢劑的作用是不同的，或者說(shuō)作用力量強(qiáng)弱不同。

1、SDS屬于離子型去垢劑，效果最強(qiáng)，基本可以把細(xì)胞核膜破壞掉，DNA會(huì)釋放出來(lái)，裂解液變得很粘稠。

2、NP-40是很溫和的去垢劑，1%濃度的基本可以破壞掉胞膜，而對(duì)核膜破壞的作用弱，結(jié)合特定的buffer可以獲得胞漿蛋白。

3、TritonX-100的能力介于NP40和SDS之間，偏向于NP40，也是常用的細(xì)胞裂解液成分之一，在保護(hù)蛋白活性方面有一定作用（SDS基本會(huì)使蛋白變性失活）。

去垢劑屬性只是一方面，buffer、配比、濃度、提取方法和材料處理也都是關(guān)鍵因素

由于很多裂解液都是蛋白變性劑,對(duì)酶活力的測(cè)定有一定的影響,一般不推薦用裂解液進(jìn)行裂解。

④反復(fù)凍融:

在細(xì)胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根據(jù)所測(cè)指標(biāo)的不同而有所改變，一般加入0.5ml，細(xì)胞密度不小于一百萬(wàn)個(gè)/ml），混勻，將細(xì)胞懸浮于PBS中，放低溫冰箱中結(jié)冰，溶解，再結(jié)冰，再溶解，反復(fù)3次左右）。由于反復(fù)凍融對(duì)酶活力影響較大，一般使用生化法測(cè)酶活時(shí)不能使用。